Human BBB-brain organoid on a millifluidic plate for modeling brain parenchymal pathology-induced barrier dysfunction

人血脑屏障-脑类器官微流控芯片：模拟脑实质病理诱导的屏障功能障碍

Journal of Advanced Research (IF=13.0) | 2026

作者：Lili Zhu, Wen Zhao, Min Shen, Yuwen Wang, Jibo Wang, Yunnan Liu, Tao Chen, Xuemei Huan, Bo Tang, Jian Shen, Linlin Bi, Dong Wang, Zhentao Zhang, Andreas Dietzel, Pu Chen*, Longqiu Yang*

DOI: 10.1016/j.jare.2026.06.024 | PMID: 42324019

通讯作者：yanglongqiu@126.com (L. Yang); puchen@whu.edu.cn (P. Chen)

摘要

目的：血脑屏障（BBB）维持脑稳态，其功能障碍是许多神经系统疾病的关键病理机制。然而，现有BBB模型缺乏功能性脑实质，限制了BBB-实质相互作用机制研究及药物评价。

方法：利用人脑微血管内皮细胞（hBMECs）和周细胞（hBVPs）在微流控板上构建工程化BBB模型。将人iPSC来源的脑类器官（hBOs）共培养形成BBOC体系。通过Aβ42寡聚体（Aβ42O）诱导实质病理，研究其对BBB功能与完整性的影响。

结果：条件培养基（CM）和动态流提高了内皮细胞活性。与hBOs共培养显著增强了BBB功能，TEER值升高，分子通透性降低。Aβ42O处理的hBOs表现出脑实质病理表型（神经突起丧失、干细胞增殖受损、细胞凋亡增加、细胞因子基因转录上调）。病理hBOs破坏了BBB（紧密连接蛋白↓、通透性↑、屏障完整性受损）。

结论：BBOC模型再现了实质与BBB的生理和病理相互作用，证实脑实质活性直接调控BBB完整性。该模型为神经系统机制研究和靶向药物筛选提供了新工具。

关键词：Brain organoid on a chip; Millifluidic plate; Brain parenchymal pathology; BBB dysfunction; Neurodegenerative disease

1. 微流控板的设计与制备

研究团队按照八步组织工程和器官制造（TEOM）流程，设计了用于BBOC模型的微流控板。基于12孔板嵌入12个功能插件构建，每个插件包含由多孔PETE膜分隔的上下腔室。倾斜摇床（旋转角度14°，周期5秒）产生重力驱动的周期性双向流，提供恒定的流体流动（3-5 × 10⁻² cm/s）和持续的流体剪切应力（0.022 dyn/cm²）作用于膜底面。数值模拟和染料灌注实验显示，上下腔室在1小时内即可实现快速营养交换。

Fig. 1
图1 | 微流控板的设计、制备与数值模拟。 （A）微流控板组装过程示意图。（B）微流控板组成示意图。（C）嵌入12孔板的插件实物照片。（D）单个插件剖面图。（E）插件参数示意图。（F）流场数值模拟。（G）剪切应力数值模拟。（H）扩散模拟与染料灌注实验。
Fig. 1. Design, fabrication, and numerical simulation for a millifluidic plate. (A) Schematic illustration of the assembly process for a millifluidic plate. (B) Schematic of the composition. (C) Photographs of a millifluidic plate. (D) Sectional diagram of an individual insert. (E) Schematic of the parameters. (F-G) Numerical simulations of the flow field and shear stress. (H) Diffusion simulations and dye perfusion experiments.

2. 条件培养基增强内皮屏障性能

为优化hBMECs和hBVPs的共培养效率和稳定性，团队优化了条件培养基（CM，ECM:PM=1:4）。细胞活力分析显示，CM中的hBMECs和hBVPs活性显著高于对照组。免疫荧光分析表明，CM未显著改变CD31阳性细胞面积和荧光强度。CM显著提高了单层hBMECs的电阻值、降低了10 kDa FITC-葡聚糖渗透性，并上调了紧密连接蛋白CLDN5的mRNA水平。

📊 关键数据：CM显著提高单层hBMEC电阻值；10 kDa FITC-葡聚糖渗透性↓；CLDN5 mRNA↑；而ZO-1和P-gp表达水平无显著变化。
Fig. 2
图2 | 条件培养基（CM）对hBMECs和hBVPs的影响。 （A-C）细胞活力检测。（D-E）CD31/PDGFR-β免疫荧光与定量。（F-G）RT-qPCR分析。（H-K）CM对单层hBMEC屏障功能的影响。
Fig. 2. Effects of CM on hBMECs and hBVPs. (A-C) Cell viability assays. (D-E) Immunofluorescence and quantitative analysis. (F-G) RT-qPCR analysis. (H-K) Barrier function of hBMEC monolayer in CM.

3. 动态条件下单层内皮细胞的建立

为探索重力驱动的双向动态流对内皮屏障功能的影响，研究比较了动态与静态条件下单层hBMECs的培养效果。结果发现，动态与静态条件下TEER值和FITC-葡聚糖渗透性无统计学显著差异，但动态培养显著增加了CD31阳性细胞的荧光强度。双向动态流下，VE-cadherin和ZO-1沿内皮单层连续分布。

Fig. 3
图3 | 动态条件对单层BBB的影响。 （A）动态/静态培养示意图。（B）TEER监测。（C）渗透性定量。（D-E）CD31免疫荧光与定量。（F）RT-qPCR分析。（G）动态条件下VE-cadherin/ZO-1原位免疫荧光。
Fig. 3. Effects of dynamic conditions on the monolayer BBB. (A) Schematic. (B) TEER. (C) Permeability. (D-E) CD31 IF. (F) RT-qPCR. (G) VE-cadherin and ZO-1 in situ IF under dynamic flow.

4. BBB模型的建立与表征

为探究周细胞在内皮屏障功能中的作用，研究在微流控板上建立了由hBMEC和hBVP单层堆叠组成的BBB模型，使用CM在动态条件下培养。

📊 关键数据：hBVPs使TEER值从50.73±9.13 Ω·cm²提高至74.50±22.80 Ω·cm²（↑46.86%）。10 kDa FITC-葡聚糖渗透性从2.47±0.97×10⁻⁷ cm/s降至1.64±0.47×10⁻⁷ cm/s（↓33.60%）。紧密连接蛋白和转运蛋白mRNA上调1.55-2.01倍。
Fig. 4
图4 | BBB模型的建立与表征。 （A）BBB模型建立示意图。（B）TEER连续8天监测。（C）10 kDa FITC-葡聚糖渗透性。（D）RT-qPCR分析。（E）ZO-1/VE-cadherin/CD31/PDGFR-β免疫荧光。
Fig. 4. Establishment and characterization of BBB model. (A) Schematic. (B) TEER. (C) Permeability. (D) RT-qPCR. (E) Immunofluorescence of ZO-1, VE-cadherin, CD31, PDGFR-β.

5. 脑类器官促进BBB功能

为探索BBB与脑实质之间的相互作用，研究建立了BBOC模型，将iPSC来源的脑类器官（采用Lancaster & Knoblich方案经改良生成）整合到BBB模型中。D23 hBOs被载入上腔室，与BBB结构动态共培养7天。

WB分析显示BBOC组与对照组SOX2、PAX6、TUJ1、MAP2蛋白表达无显著差异。免疫荧光显示两组hBOs中神经祖细胞标记（SOX2、Nestin）、神经元标记（TUJ1、MAP2）和区域标记（PAX6、ISL1）的分布模式相似。

📊 关键数据：BBOC模型TEER从71.61±10.32 Ω·cm²升至86.31±18.37 Ω·cm²（↑20.53%）。10 kDa FITC-葡聚糖渗透性从1.66±0.10×10⁻⁷ cm/s降至9.50±4.32×10⁻⁸ cm/s（↓42.78%）。周细胞功能基因PDGFR-β和NG2的mRNA上调9.40-15.14倍（特异性来自hBOs而非机械刺激——硅球对照组无此效应）。
Fig. 5
图5 | 脑类器官增强BBB功能。 （A）BBOC模型建立示意图。（B）BBOC模型明场图。（C）WB分析。（D）免疫荧光成像。（E）TEER监测。（F）FITC-葡聚糖渗透性。（G）ZO-1/CLDN5 WB。（H）原位免疫荧光。（I）周细胞功能基因RT-qPCR。
Fig. 5. The hBOs enhanced BBB function. (A) Schematic. (B) Bright field. (C) Western blot. (D) IF. (E) TEER. (F) Permeability. (G) WB of ZO-1/CLDN5. (H) In situ IF. (I) Pericyte gene RT-qPCR.

6. 脑类器官呈现脑实质病理表型

β-淀粉样蛋白（Aβ）在神经退行性过程中发挥重要作用。为确定诱导hBOs损伤表型的合适Aβ42O浓度，团队在2.5-7.5 μM范围内进行了浓度梯度实验。RT-PCR显示5 μM和7.5 μM Aβ42O显著增加了TNF-α mRNA水平，降低了MAP2和PSD95 mRNA表达。最终选择5 μM Aβ42O处理72小时建立病理表型。

📊 关键病理数据：TUJ1阳性细胞面积↓1.46倍，TUJ1蛋白↓1.35倍（神经突起丧失）。SOX2/Ki67双阳性细胞比例↓1.47倍（干细胞增殖受损）。TUNEL阳性细胞比例↑2.50倍（细胞凋亡增加）。炎症因子IL-1β、TNF-α、HLA-DR、CX3CR1 mRNA上调1.33-1.68倍。
Fig. 6
图6 | hBOs呈现脑实质病理表型。 （A）实验方法示意图。（B）免疫荧光成像。（C）TUJ1阳性细胞面积定量。（D）TUJ1 WB。（E）SOX2/Ki67双阳性细胞比例。（F）TUNEL凋亡检测。（G）炎症因子RT-qPCR。
Fig. 6. The hBOs exhibited pathological phenotypes of brain parenchyma. (A) Methodology. (B) IF images. (C) TUJ1+ area. (D) TUJ1 WB. (E) SOX2/Ki67+ cells. (F) TUNEL. (G) Cytokine RT-qPCR.

7. 病理表型脑类器官损伤BBB功能

为模拟内源性实质病理介导的BBB损伤，研究将Aβ42O处理后的病理hBOs（D7）与成熟BBB在流动条件下共培养3天，建立病理BBOC模型。

🔬 核心发现：病理hBOs导致：
1. 70 kDa FITC-葡聚糖渗透性从3.27±1.94×10⁻⁸ cm/s升至2.29±0.82×10⁻⁷ cm/s（↑600.30%）
2. 10 kDa FITC-葡聚糖渗透性从2.81±0.73×10⁻⁷ cm/s升至8.06±1.44×10⁻⁷ cm/s（↑186.83%）
3. BBB功能基因CD31、CLDN5、OCLN mRNA下调1.23-1.76倍
4. PDGFR-β阳性细胞覆盖率↓14.77倍（周细胞脱落）
5. CD31荧光强度、覆盖率和细胞数↓1.27-2.02倍（内皮功能障碍）
6. ZO-1阳性面积↓1.27倍，ZO-1阳性长度↓3.37倍（紧密连接破坏）
Fig. 7
图7 | Aβ42O诱导的病理hBOs损伤BBB功能。 （A）病理BBOC模型方法示意图。（B）FITC-葡聚糖渗透性。（C）RT-qPCR分析。（D）PDGFR-β原位免疫荧光与定量。（E）CD31原位免疫荧光与定量。（F）ZO-1原位免疫荧光与分布。
Fig. 7. Aβ42O-induced pathological hBOs impaired BBB function. (A) Schematic. (B) Permeability. (C) RT-qPCR. (D) PDGFR-β in situ IF. (E) CD31 in situ IF. (F) ZO-1 distribution.

讨论

开发包含脑实质的BBB模型是微生理学领域的一项重要挑战。本研究通过融合生物工程和发育生物学来应对这一挑战：首先通过逆向工程将BBB简化为堆叠的hBMEC和hBVP单层，然后引入iPSC来源的脑类器官代表脑实质。基于这一生物设计，微流控板通过将微流控插件嵌入12孔板制备而成。

模型验证：共培养BBB模型TEER为74.50±22.80 Ω·cm²，10 kDa FITC-葡聚糖P_app为1.64±0.47×10⁻⁷ cm/s，与文献报道的原代hBMEC体外BBB模型基准值（TEER 30-100 Ω·cm²，P_app ~1.7×10⁻⁷ cm/s）一致。BBOC模型将TEER提升至86.31±18.37 Ω·cm²，10 kDa FITC-葡聚糖渗透性降至9.50±4.32×10⁻⁸ cm/s，优于当前许多BBB芯片系统。

BBB-实质相互作用：研究结果显示脑实质（hBOs）显著增强了BBB功能，周细胞功能基因mRNA上调9.40-15.14倍。重要的是，硅球对照实验证实这种增强效应来自hBOs的生物活性而非机械刺激。

病理机制：病理BBOC模型中BBB损伤的可能机制包括：（1）病理脑类器官释放促炎细胞因子（TNF-α、IL-1β）破坏内皮紧密连接；（2）应激神经细胞释放的细胞外囊泡传递调节分子；（3）代谢改变和氧化应激。这些多模式相互作用为病理BBB破坏提供了合理的解释。

局限性：研究使用了D20-30的早期hBOs，该阶段以神经祖细胞和早期神经元为主，星形胶质细胞尚未成熟，小胶质细胞缺乏。这是后续优化的方向——通过整合iPSC来源的内皮细胞、周细胞和胶质细胞，在3D环境中更全面再现BBB-脑实质的复杂细胞-细胞和细胞-基质相互作用。

结论

本研究开发了BBOC模型，通过整合脑类器官和BBB结构来模拟脑实质病理诱导的屏障功能障碍。hBOs显著增强了工程化BBB的屏障功能。Aβ42O处理的hBOs在体外呈现脑实质病理表型，并诱导了明显的BBB破坏（紧密连接蛋白表达↓、通透性↑、屏障完整性受损）。该模型作为研究BBB与脑实质之间生化相互作用的新工具，在神经系统机制研究和药物发现（特别是新一代麻醉药物、神经肽、脂质纳米颗粒的BBB转运性评估和脑实质毒性/有效性评价）方面具有应用前景。

材料与方法

微流控板制备

功能插件（PMMA）通过CO₂激光雕刻系统制备。每个插件由PETE膜（孔径0.4 μm，厚度12 μm，孔密度2×10⁶ pores/cm²）分隔上下腔室。PDMS预聚物作为粘合剂。微流控板在80°C烘箱中固化2小时，紫外线灭菌24小时。有效膜面积0.50 cm²。通过倾斜摇床驱动流体流动。

数值模拟

使用COMSOL Multiphysics软件。采用"Free and porous media flow"模块模拟微通道流体运动。PETE膜的孔隙率根据公式ε=πρd²/4计算。膜的渗透性在无/有细胞附着时分别调整为2.5×10⁻¹⁶ m²或2.5×10⁻¹⁷ m²。营养扩散系数设为5.15×10⁻¹⁰ m²/s。

细胞培养

原代hBMECs（中国典型培养物保藏中心）使用内皮细胞培养基（ECM）维持。原代hBVPs（Procell）使用周细胞培养基（PM）维持。细胞传代4-8代。条件培养基（CM）为ECM:PM=1:4混合。

脑类器官生成

采用Lancaster & Knoblich改良方案。H9 hESCs用Accutase解离为单细胞后接种于超低吸附36孔板形成胚状体（6天），转移至诱导培养基（至D11），包埋于Matrigel后在神经扩增培养基中培养3天，然后转移至双向摇床平台（倾斜角度25°，周期20秒），最后更换为神经成熟培养基长期培养。每次分化生成24-36个hBOs。

BBOC模型构建

BBB模型由PETE膜两侧的hBMECs（每插件1.5×10⁵细胞）和hBVPs（每插件5×10⁴细胞）组成。D23 hBOs载入上腔室后，在倾斜摇床（旋转角度14°，周期5秒，最大角加速度约0.385 rad/s²）上共培养7天。上下腔室分别每日更换神经成熟培养基和CM。

病理BBOC模型

Aβ42肽溶于DMSO后用DMEM/F12无酚红培养基稀释至100 μM，涡旋30秒后在4°C孵育24小时获得Aβ42O。Aβ42O在神经成熟培养基中稀释至5 μM，与D20 hBOs孵育72小时。处理后的hBOs洗涤3次以去除游离Aβ42O，然后载入D7 BBB模型上腔室，动态共培养3天。

TEER测量

使用STX2电极连接细胞电阻仪（WPI EVOM2），每天测量，连续8天。施加10 μA振幅方波信号（12.5 Hz）。有效接触面积0.50 cm²。TEER = (R-R₀) × A（Ω·cm²）。

渗透性检测

使用10 kDa和70 kDa FITC-葡聚糖。下腔室加入600 μL 500 μg/mL FITC-葡聚糖稀释液，上腔室加入200 μL神经成熟培养基。在倾斜摇床上37°C孵育30分钟后，收集上腔室100 μL培养基，使用微孔板检测仪在492/518 nm（激发/发射）测定荧光。表观渗透系数P_app = Vt×Ct/(A×C₀×t)。

RT-qPCR

使用Trizol试剂分别提取hBMECs、hBVPs和hBOs总RNA。检测hBMEC内皮功能基因（CD31、CLDN5、OCLN、P-gp、ZO-1）、hBVP周细胞功能基因（PDGFR-β、NG2）和hBO细胞因子相关基因（IL-1β、TNF-α、HLA-DR、CX3CR）。使用GAPDH作为内参基因，2⁻ΔΔCt方法分析。引物特异性经NCBI Primer-BLAST确认。

Western blot

hBOs蛋白浓度通过micro BCA蛋白检测试剂盒测定。蛋白裂解液经10% SDS-PAGE分离（100 V 10 min，200 V 20 min），转移至硝酸纤维素膜（400 mA 30 min）。5%脱脂奶粉/TBST封闭后，一抗4°C过夜孵育，对应HRP标记二抗室温孵育1小时。检测SOX2、PAX6、TUJ1、MAP2等神经相关蛋白。使用ImageJ分析灰度值。

免疫荧光染色

微流控板中细胞：4%多聚甲醛固定15分钟，1% BSA封闭1小时，一抗4°C过夜，对应二抗室温避光2小时，DAPI染色5分钟。倒置荧光显微镜Z轴层扫照相（每层5 μm）。hBOs：4%多聚甲醛固定24小时，15%和30%蔗糖梯度脱水24小时，冰冻切片后进行免疫荧光染色。

TUNEL检测

hBOs冰冻切片用0.5% TritonX-100透化5分钟，TUNEL反应液（C1090, Beyotime）37°C避光孵育60分钟，荧光显微镜观察。细胞凋亡以TUNEL阳性细胞/DAPI阳性细胞比例表示。

统计分析

使用GraphPad Prism 8.0.2分析，数据以mean±SEM表示。TEER数据使用双因素ANOVA+Tukey多重比较检验，其他数据使用非配对Student's t检验。参数检验前进行Shapiro-Wilk正态性检验和方差齐性检验。

图注汇总

Figure 1. Design, fabrication, and numerical simulation for a millifluidic plate. (A) Schematic illustration of the assembly process. (B) Schematic of the composition. (C) Photographs. (D) Sectional diagram. (E) Parameter schematic. (F) Flow field simulations. (G) Fluid shear stress simulations. (H) Diffusion simulations and dye perfusion experiments.

Figure 2. Effects of CM on hBMECs and hBVPs. (A-C) Cell viability assays. (D-E) Immunofluorescence imaging and quantitative analysis of CD31 and PDGFR-β. (F-G) RT-qPCR analysis. (H) Schematic. (I) TEER. (J) Permeability of 10 kDa FITC-dextran. (K) RT-qPCR of CLDN5.

Figure 3. Effects of dynamic conditions on the monolayer BBB. (A) Schematic. (B) TEER measurement. (C) Permeability of 70 kDa and 10 kDa FITC-dextran. (D-E) CD31 IF. (F) RT-qPCR. (G) In situ IF of VE-cadherin and ZO-1.

Figure 4. Establishment and characterization of BBB model. (A) Schematic. (B) TEER. (C) Permeability of 10 kDa FITC-dextran. (D) RT-qPCR analysis of tight junction proteins and efflux transporter. (E) Immunofluorescence of ZO-1, VE-cadherin, CD31, and PDGFR-β.

Figure 5. The hBOs enhanced BBB function. (A) Establishment of BBOC model. (B) Bright fields. (C) WB of SOX2, PAX6, TUJ1, MAP2. (D) IF. (E) TEER. (F) Permeability of 70 kDa and 10 kDa FITC-dextran. (G) WB of ZO-1 and CLDN5. (H) In situ IF. (I) RT-qPCR of pericyte functional genes.

Figure 6. The hBOs exhibited pathological phenotypes of brain parenchyma. (A) Schematic of methodology. (B) IF imaging. (C) Quantification of TUJ1+ area. (D) WB of TUJ1. (E) Proportion of SOX2/Ki67 double-positive cells. (F) TUNEL assay. (G) RT-qPCR of cytokine genes.

Figure 7. Aβ42O-induced pathological hBOs impaired BBB function. (A) Schematic. (B) Permeability of 70 kDa and 10 kDa FITC-dextran. (C) RT-qPCR of BBB functional genes. (D-F) In situ IF and quantitative analysis of PDGFR-β, CD31, and ZO-1.

本文为 Journal of Advanced Research (2026) 原文全文中文报告 | DOI: 10.1016/j.jare.2026.06.024

（本文内容未经压缩，保留原文全部信息）