慢性乙醇暴露诱导人iPSC源性皮质神经元和脑类器官中β-淀粉样蛋白沉积与神经元成熟障碍

1. 研究背景与目的

饮酒与痴呆风险（包括阿尔茨海默病，AD）的增加有关，但乙醇对人类神经系统的直接影响尚不明确。本研究利用人iPSC源性的皮质神经元、球体（spheroids）和脑类器官（cerebral organoids），系统评估生理相关浓度乙醇暴露7天后对神经元成熟、树突形态、电生理活动及AD相关病理标志的影响。

2. 主要发现

3. 实验设计

• 细胞模型： 3种人iPSC系（CMC3, CMC9, CMC11），经小分子定向分化为皮质神经元（SB431542 + Dorsomorphin双重SMAD抑制）
• 3D模型： 皮质球体（spheroids）和脑类器官（cerebral organoids）
• 乙醇处理： 0、25、100 mM乙醇，暴露7天，每2天更换含乙醇培养基
• 检测方法： qRT-PCR、Western blot、免疫荧光、ELISA（Aβ40/Aβ42）、MEA（多电极阵列）

4. 详细结果

4.1 乙醇暴露不影响细胞活力（Fig. 1）

图1 | 乙醇暴露维持iPSC源性皮质神经元活力

a. 皮质神经元分化流程示意图。b. 皮质祖细胞标志物（NESTIN, PAX6）和成熟神经元标志物（TUJ1, MAP2）的mRNA表达。c. MTT细胞活力检测显示各浓度乙醇暴露7天后无显著差异。d. LDH释放检测无显著差异。e. Calcein AM/PI活/死染色。f. Ki67增殖标志物无显著变化。n=3个独立分化批次。

Fig. 1 | Ethanol exposure maintains viability in iPSC-derived cortical neurons. a. Schematic of cortical neuron differentiation. b. mRNA expression of cortical progenitor and mature neuron markers. c-f. Viability assays (MTT, LDH, Live/Dead, Ki67) showing no significant cytotoxicity at 25 or 100 mM ethanol for 7 days.

MTT和LDH检测及各浓度下均未观察到显著细胞毒性，表明后续观察到的分子和功能变化并非由细胞死亡引起。

4.2 乙醇损害皮质神经元身份和胶质标志物表达（Fig. 2）

图2 | 慢性乙醇暴露损害皮质神经元身份并改变胶质标志物

a-b. 皮质神经元标志物（TUJ1, MAP2, CTIP2, SATB2）的mRNA表达，呈浓度依赖性降低。c-d. Western blot分析TUJ1和MAP2蛋白水平。e-f. TUJ1和MAP2免疫荧光染色定量。g-i. 兴奋性（vGLUT1）和抑制性（GAD67）突触标志物的Western blot分析。h-j. 胶质标志物（GFAP, Iba1, S100B）表达变化。

Fig. 2 | Chronic ethanol exposure impairs cortical neuron identity and alters glial marker expression. a-j. Concentration-dependent reduction in cortical neuronal markers (TUJ1, MAP2, CTIP2, SATB2) at mRNA and protein levels, with concurrent changes in glial markers (GFAP, Iba1, S100B).

25 mM和100 mM乙醇处理7天后，神经元标志物表达显著下降，同时观察到胶质标志物（GFAP, Iba1, S100B）的表达变化。

4.3 乙醇促进淀粉样蛋白生成和tau病理（Fig. 3）

图3 | 慢性乙醇暴露促进iPSC源性皮质神经元中淀粉样蛋白生成和tau相关病理变化

a-b. ADAM10（α-分泌酶）表达降低，BACE1（β-分泌酶）表达升高。c. ELISA显示Aβ42水平以浓度依赖性方式升高。d-e. CTF-α和CTF-β未见显著差异。f-i. ADAM10和BACE1的免疫荧光染色及定量。j. p-tau (AT8)免疫反应性增强。Scale bars: 20 μm.

Fig. 3 | Chronic ethanol exposure promotes amyloidogenic processing and tau-related pathological changes. a-j. Ethanol induces a shift toward amyloidogenic APP processing (decreased ADAM10, increased BACE1, elevated Aβ42) and increased p-tau immunoreactivity in a concentration-dependent manner.

乙醇暴露导致ADAM10下调、BACE1上调、Aβ42水平升高，以及p-tau（AT8）免疫反应性增强，表明乙醇激活了AD相关病理途径。

4.4 乙醇抑制自发和诱发的神经元电活动（Fig. 4）

图4 | 慢性乙醇暴露降低iPSC源性皮质神经元的自发和诱发电活动

a. 热图显示自发锋电位活动。b. 平均放电率（MFR）在100 mM组显著降低。c. 爆发活动频率。d. 网络内爆发百分比呈下降趋势。e. 同步指数。f. 簇周期长度。g. 网络爆发频率。h. 电刺激诱发的网络反应性。

Fig. 4 | Chronic ethanol exposure reduces spontaneous and evoked neuronal activity. a-h. MEA recordings show reduced mean firing rate, burst frequency, network synchrony, and evoked responsiveness in ethanol-treated cortical neurons.

MEA分析显示，100 mM乙醇暴露后神经元自发和诱发的电活动显著降低，网络同步性受损。

4.5 乙醇损害球体模型中的神经突生长（Fig. 5）

图5 | 乙醇暴露损害皮质球体神经突生长

a. 实验流程：球体接种至层粘连蛋白包被培养板促进部分贴壁和神经突延伸。b-c. 乙醇浓度依赖性Aβ生成增加。d. 球体贴壁后神经突延伸。e. 神经突束形成受抑制。f. 神经突长度定量分析。g. 单个球体分析。

Fig. 5 | Ethanol exposure impairs spheroid neurite outgrowth. a-g. Cortical spheroids treated with ethanol show impaired neurite extension and bundle formation in a concentration-dependent manner, accompanied by increased amyloidogenic processing.

3D球体模型中，乙醇暴露导致神经突长度缩短、束形成减少，同时在球体中也观察到淀粉样蛋白生成的增强。

4.6 脑类器官模型验证（Fig. 6）

图6 | 脑类器官中乙醇诱导的神经元身份丧失和Aβ沉积

a. 脑类器官全组织免疫染色：TUJ1（绿色）和Aβ MOC98（红色）。b. TUJ1和Aβ荧光强度定量。c. BACE1和ADAM10蛋白表达。d. Western blot定量。e. qRT-PCR分析。f. 透射电镜显示乙醇暴露后细胞内Aβ聚集体。Scale bars: 100 μm.

Fig. 6 | Ethanol-induced loss of neuronal identity and Aβ deposition in cerebral organoids. a-f. Cerebral organoids treated with ethanol show reduced TUJ1 expression, increased Aβ deposition, elevated BACE1, and decreased ADAM10, recapitulating key features observed in 2D models.

脑类器官模型进一步证实了乙醇暴露导致神经元身份丧失和Aβ沉积增加。在25 mM和100 mM乙醇处理的类器官中，TUJ1表达逐渐减少，而Aβ（MOC98）免疫反应性呈剂量依赖性增加。Western blot分析证实BACE1上调、ADAM10下调，表明淀粉样蛋白生成途径的激活。

5. 结论与意义

本研究通过人iPSC源性2D和3D神经模型系统，证明了慢性乙醇暴露可损害皮质神经元成熟、突触完整性和电生理活性，同时促进淀粉样蛋白生成和tau相关病理变化。研究结果揭示了饮酒作为AD风险因素的直接细胞机制，并为评估生活方式相关神经退行性风险因素的人iPSC平台提供了新见解。

6. 论文信息