甘氨酸转运体Slc6a20a-ASO恢复SHANK2和SHANK3突变小鼠及皮层类器官中的NMDA受体功能

摘要: NMDA受体（NMDAR）功能抑制与多种脑疾病相关，包括精神分裂症、自闭症谱系障碍（ASD）和NMDAR脑炎。既往通过抑制GlyT1（甘氨酸转运体1）提高环境甘氨酸（glycine）水平以恢复NMDAR活性的尝试效果不一，部分原因是GlyT1在脑干区域广泛表达。Slc6a20a是一种在皮层和海马等认知相关区域广泛表达的甘氨酸转运体，提供了更具靶向性的替代方案。本研究表明，反义寡核苷酸（ASO）介导的Slc6a20a抑制（Slc6a20a-ASO）可正常化雄性Shank2和Shank3突变小鼠的ASD相关表型，且挽救谱具有模型依赖性。Slc6a20a-ASO可恢复前额叶皮层（prefrontal cortex, PFC）的NMDAR功能低下和突触磷酸化蛋白质组谱。此外，靶向人类SLC6A20的ASO可在携带SHANK2或SHANK3突变的人皮层类器官（cortical organoids）中恢复受抑的NMDAR功能。这些发现揭示了Slc6a20a/SLC6A20-ASO治疗以NMDAR功能低下为特征的疾病的潜力与局限性。

NMDA受体（NMDAR）在脑发育和功能调节中发挥关键作用^1,2。NMDAR功能异常与多种神经、神经发育及精神疾病相关^1,3，包括精神分裂症^4-6、自闭症谱系障碍（ASD）^3,7-13、智力残疾^14-16、NMDAR脑炎^17,18以及Phelan-McDermid综合征（PMS）^19,20。

恢复NMDAR功能低下的一个策略是靶向甘氨酸转运体，调控作为NMDAR共激动剂（co-agonist）的甘氨酸水平^2,11,23。关键转运体GlyT1介导甘氨酸的再摄取，抑制GlyT1可提高环境甘氨酸水平并增强NMDAR功能^25,26。然而，GlyT1抑制剂在人临床试验中疗效有限且存在显著副作用——因GlyT1在脑干区域高表达^25,31，其抑制可导致非正常的甘氨酸受体激活，干扰呼吸和运动调节^32,33。

最近研究发现Slc6a20a是一种新型甘氨酸转运体，其上调可降低环境甘氨酸水平导致NMDAR功能低下³⁴。通过反义寡核苷酸（ASO）抑制Slc6a20a可增加环境甘氨酸浓度并恢复NMDAR功能³⁴。重要的是，Slc6a20a主要在皮层和海马等认知功能区以及脉络丛和脑膜区域表达³⁴，提示Slc6a20a-ASO可为缓解NMDAR功能低下提供更靶向、更有效的方法。本研究在Shank2和Shank3突变小鼠模型^36-39及携带相应SHANK2/SHANK3突变的人皮层类器官中验证了这一假说。

通过侧脑室注射（ICV）将Slc6a20a-ASO递送至Shank2和Shank3突变小鼠脑内（Fig. 1a）。注射后4周进行行为学、电生理及蛋白质组学分析。ASO有效降低了Slc6a20a mRNA水平，未引起细胞毒性，且抑制效果遍及前额叶皮层（prefrontal cortex, PFC）、纹状体和海马等多个脑区及神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞（Supplementary Fig. 1）。

在Shank2-KO小鼠中，Slc6a20a-ASO恢复了内侧前额叶皮层（mPFC）第2/3层锥体神经元的NMDAR电流，表现为NMDA/AMPA比值的恢复（Fig. 1b）。AMPAR介导的突触传递不受影响（Supplementary Fig. 2a）。行为学方面，ASO挽救了Shank2-KO小鼠的三箱社交互动缺陷（Fig. 1c; Supplementary Fig. 2b）。成年Shank2-KO小鼠的发声超声（USV）几乎完全消失，经ASO治疗后部分恢复（Supplementary Fig. 2d）。然而，旷场多动和埋珠行为未被挽救（Supplementary Fig. 2f,g）。

Shank3突变小鼠（缺失外显子21，Shank3-ΔC）表现出NMDAR功能低下和ASD样社交认知缺陷及重复行为^41,43,44。本研究使用纯合突变（Shank3-HM）和杂合突变（Shank3-HT）小鼠。

Slc6a20a-ASO处理后的Shank3-HM小鼠NMDAR功能恢复（NMDA/AMPA比值），AMPAR介导的mEPSCs不受影响（Fig. 2a; Supplementary Fig. 6a）。行为学上，ASO改善了居家笼和LABORAS笼中的自我理毛行为（Fig. 2b,c）。Shank3-HM小鼠社交互动异常增高（因异常物体厌恶导致），ASO可挽救（Supplementary Fig. 6b,c）。成年Shank3-HM小鼠的USV减少被ASO挽救（Supplementary Fig. 6d）。居家笼社交接近减少也被挽救，而埋珠未被挽救（Supplementary Fig. 6e,f）。

鉴于杂合Shank3突变在临床上更为常见，本研究验证了Slc6a20a-ASO在Shank3-HT小鼠中的效果。ASO恢复了NMDA/AMPA比值且不影响AMPAR介导的mEPSCs（Fig. 3a, Supplementary Fig. 10a）。自我理毛行为有向WT水平靠近的趋势，基因型×处理交互作用显著（Fig. 3b）。

磷酸化蛋白质组学分析显示，ASO挽救的DEPPs包括Pclo、Eif4g3、Tsc1、Braf、Ppp3cb和Iqsec2等突触蛋白（Fig. 3c,d），富集于谷氨酸能突触、突触后密度、肌动蛋白和小GTP酶相关功能（Fig. 3e）。功能聚类主题包括膜运输、轴突与神经发育、突触与突触后过程、Rho相关通路等（Fig. 3f）。Shank3-HT与Shank3-HM小鼠的ASO挽救DEPPs有64个重叠，富集于NMDAR和突触相关功能（Fig. 3g）。

三个模型（Shank2-KO、Shank3-HM、Shank3-HT）共同富集的KEGG通路包括谷氨酸能突触、内吞和催产素通路（Supplementary Data 8），其中PSD-95/Dlg4、钙调神经磷酸酶（PP2B/calcineurin）、腺苷酸环化酶（AC）、电压门控钙通道（VGCC）、动力蛋白（dynamin）和Arp2/3等是关键调节组分。

Slc6a20a-ASO的靶基因抑制效果可持续至注射后8周（Supplementary Fig. 16a）。ASO对所有三种突变小鼠品系的体重影响极小（Supplementary Fig. 16b），表明长期使用无有害效应。在Shank2-KO小鼠中，ASO在注射后8周仍可挽救社交互动（Supplementary Fig. 16c）。8周后Shank2-KO小鼠的攀爬行为显著增加（此为发育阶段依赖的表型），ASO可挽救（Supplementary Fig. 16e）。在Shank3-HM小鼠中，8周后增加的自我理毛在暗周期部分挽救（Supplementary Fig. 16k）。这些结果共同表明Slc6a20a-ASO具有持久的分子和行为效应，不引起不良后果。

为验证人类神经元的适用性，使用CRISPR在H1胚胎干细胞中引入SHANK2（外显子16）和SHANK3（外显子21）的纯合移码突变（Fig. 4a,b）。突变的hESCs分化为皮层类器官（cortical organoids），通过免疫染色和单细胞转录组学验证了神经前体细胞（Nestin+）和成熟神经元（NeuN+）以及预期细胞类型（Fig. 4b; Supplementary Fig. 17）。

SLC6A20-ASO剂量依赖性降低SLC6A20 mRNA水平（Fig. 4c）。通过AAV-hSyn-EGFP标记神经元后进行NMDAR-mEPSC记录（Fig. 4d），发现SHANK2/SHANK3-KO神经元NMDAR-mEPSC峰值幅度降低。SLC6A20-ASO处理将其恢复至WT水平（Fig. 4e）。这证实了人类SHANK2/SHANK3-KO神经元存在NMDAR功能低下，且SLC6A20-ASO可挽救，与小鼠模型一致。

本研究证明Slc6a20a-ASO可有效恢复Shank2和Shank3 ASD/PMS小鼠模型的NMDAR功能并缓解行为缺陷。磷酸化蛋白质组学分析确认了与突触和NMDAR相关蛋白的异常磷酸化模式被逆转。在携带SHANK2/SHANK3突变的人皮层类器官中也观察到NMDAR功能的恢复，强调了SLC6A20-ASO的转化潜力。

Slc6a20a-ASO相对于广谱GlyT1抑制剂的优势在于其区域特异性表达，可减少副作用。Slc6a20a主要在皮层和海马区域表达，而GlyT1在脑干区域高表达，抑制后会导致呼吸和运动调节异常^31-33。此外，Slc6a20a在脑膜中的表达提示其在调控脑与外周组织间甘氨酸流动中的作用。

本研究将Slc6a20a-ASO的治疗应用从最初在Pten突变小鼠中的发现扩展到多种ASD模型。值得注意的是，不同行为表型被差异化挽救——社交互动和USV改善，而多动症未被挽救——可能反映了各行为的NMDAR依赖性差异。磷酸化蛋白质组学鉴定了Syngap1、Dlgap1和Pyk2等关键突触蛋白的磷酸化被ASO逆转，通路分析确定了谷氨酸能突触、内吞和催产素信号通路在多个模型中一致性正常化。

与基因重表达策略相比，ASO介导的敲低具有剂量可调、可逆、药理学可预测和靶标参与度可测量等优势。NMDAR在丰度、亚基组成和共激动剂控制（甘氨酸 vs D-丝氨酸）上的异质性以及ASD的临床异质性仍是临床转化中需要面对的挑战。

动物模型: Shank2-KO小鼠缺乏外显子6-7（C57BL/6N背景）⁴⁰。Shank3tm1.1Pfw/J（Shank3-ΔC, 缺失外显子21）购自Jackson Lab（C57BL/6J背景）。仅使用雄性小鼠。所有实验经KAIST动物研究伦理委员会批准。

ASO设计与递送: ASO长度25 bp，含5个2'-O-甲氧乙基（2'-MOE）修饰核苷酸、5-甲基胞嘧啶修饰、15个中心DNA核苷酸及全硫代磷酸酯修饰。小鼠Slc6a20a-ASO序列: 5'-CACTG AGGCC GTGCC TTCTC CATGT-3'。人SLC6A20-ASO序列: 5'-CAC AGC GGC CGC GCT TTC TCC ATG G-3'。通过ICV注射递送至侧脑室。

电生理: 在mPFC前边缘区L2/3锥体神经元记录诱发的EPSCs（NMDA/AMPA比值）和微小EPSCs（mEPSCs）。类器官实验中，在NBQX、印防己毒素、TTX存在下及Mg²⁺替换为Sr²⁺条件下记录NMDAR-mEPSCs。

磷酸化蛋白质组学: 使用固定化金属亲和色谱（IMAC）富集磷酸化肽段，经质谱鉴定。共鉴定77,651条磷酸化肽段和23,513个磷酸化位点。使用Metascape、SynGO⁴²、DAVID进行功能富集分析。

人类皮层类器官: H1胚胎干细胞经CRISPR引入SHANK2（外显子16, PDZ结构域）或SHANK3（外显子21）突变，分化为皮层类器官。SLC6A20-ASO处理5天后进行电生理记录。

统计: 电生理和组学数据使用双因素ANOVA或单因素ANOVA，Tukey事后检验。p<0.05为显著。