系统性scRNA-seq筛选揭示神经类器官对形态发生素的响应图谱

📑 目录

摘要引言 1. 形态发生素条件筛选的转录组图谱 2. 形态发生素对转录调控网络的影响 3. 形态发生素的时序、浓度和组合效应 4. 组合筛选揭示形态发生素相互作用 5. 细胞系和神经诱导方法的影响 6. 形态发生素梯度与前脑DV模式化讨论方法摘要扩展数据图（10张）

摘要

形态发生素在体内将神经上皮命运导向不同的区域特性。神经类器官为研究通过形态发生素暴露实现的神经区域化提供了模型，然而我们缺乏对发育中人类神经上皮如何响应形态发生素信号的全面调查。本研究利用多重单细胞转录组测序筛选，详细绘制了形态发生素对人类神经类器官区域特化诱导效应的图谱。研究发现，形态发生素的暴露时间、浓度和组合方式显著影响类器官的细胞类型和区域组成，而细胞系背景和神经诱导方法也会影响对特定形态发生素条件的响应。研究在微流控芯片中施加浓度梯度，或在多孔板中施加递增的静态浓度，观察到两种情境下不同的模式化动力学特征。综上，本研究提供了一个详细的神经谱系特化资源，结合深度学习模型，可预测人类干细胞体系中的分化结果。

引言

CNS的精细结构起源于发育早期的严格协调模式化事件。原肠胚形成后，外胚层细胞通过旁分泌BMP4信号维持非神经组织身份。神经板通过BMP抑制和FGF激活信号从中胚层中产生，最终形成CNS。同时，在神经板边缘，具有中等BMP和高FGF/WNT信号的细胞形成神经嵴（PNS前体）。在这些谱系建立的同时，一组独特的形态发生素浓度梯度在时间和空间上相互作用，引导神经管沿前-后轴（AP）和背-腹轴（DV）的区域化。

目前CNS区域化的知识主要来自非人类动物模型，这些模型与人类相比具有不同的细胞结构、细胞行为和基因表达模式。干细胞分化和类器官技术的出现使我们能够在体外研究人类特异性神经发育。与单层神经培养仅呈现基本玫瑰花环样排列不同，神经类器官提供了三维环境，细胞可在其中自组织出与原始人脑组织相似的结构特征（如皮层分层、折叠和中间神经元迁移）。

然而，不同导向方案针对同一脑区可能产生不同结果，因为它们的培养设置不同，可能影响组织架构、区域模式化、细胞类型多样性和成熟度。新方案的开发效率低下：评估不同培养条件通常依赖于少量标志基因的批量测量，且验证往往在培养数月后进行。这忽略了对早期神经上皮模式化的研究——而这正是成功生成区域模式化、功能成熟的神经类器官的关键。

本研究目标：系统性评估形态发生素对发育中人类神经类器官的影响。在多个时间点、浓度和组合下提供模式化分子，在培养3周后使用高度多重scRNA-seq评估神经前体细胞区域化。这一时间点捕获了从多能干细胞和神经外胚层状态到神经前体细胞和神经元的多种发育阶段。

1形态发生素条件筛选的转录组图谱

为系统研究形态发生素对人类神经上皮模式化的影响，本研究建立了一个基于细胞哈希多重scRNA-seq的实验流程。神经类器官在96孔板中生成，将多能干细胞（WTC、H9、HES3，其中HES3带有NKX2.1-GFP报告基因）聚集为拟胚体，在MNIM（最小神经诱导培养基）中培养诱导神经外胚层命运。

发育中的类器官随后接受8种形态发生素的系统处理，改变其时间、浓度和组合：CHIR99021（WNT通路激活剂）、XAV939（WNT通路抑制剂）、SHH/purmorphamine、FGF8、RA（视黄酸）、BMP4、BMP7和Cyclopamine（SHH抑制剂）。第21天，各条件下的多个类器官被收集、解离，用条码抗体（cell hashing）标记后进行10x Genomics 3′ mRNA单细胞转录组测序。

核心数据：共分析了来自97个形态发生素处理条件的100,538个单细胞，涵盖3种细胞系（HES3 hES、H9 hES、WTC hiPS）、8种形态发生素、多个时间窗口（pulse 0-3d / 3-14d / 14-21d等）和5个浓度水平（c1-c5）。

通过基于参照的相似性（RSS）UMAP降维投影，所有细胞被聚类为18个细胞群体——包括端脑前体细胞、视网膜前体细胞、下丘脑/间脑细胞、中脑/后脑细胞、脊髓细胞等CNS类型，以及非神经细胞群（神经嵴、非神经外胚层、中胚层、内胚层和胚外组织）。

对照组细胞（未经形态发生素处理）在所有细胞系中主要分布于神经簇。而处理后的类器官产生了对照类器官中不存在的独特聚类，如后脑和下丘脑。单细胞转录组读数允许对每个处理条件的细胞类型组成进行定量分析。研究发现，更高的形态发生素浓度并不普遍促进更均一的细胞类型组成，而是产生新的细胞类型，逐步替代初始身份。

📊 细胞类型多样性分析（Shannon多样性指数）：大多数条件呈现一系列细胞身份，涵盖前体细胞到神经元的多个分化状态。少数条件呈现相对均一的细胞类型组成——高Cyclopamine条件和晚期低FGF8处理。

图1 | 人类神经类器官模式化的单细胞转录组图谱

a, 实验时间线及形态发生素处理方式示意图。标尺500 µm。b, 多重scRNA-seq流程。c, RSS-UMAP投影显示18个细胞簇。d, CNS神经元亚聚类。e, 按胚层着色。f-g, 对照组和单形态发生素处理组细胞分布。h, 人脑发育数据集区域标志基因。i, 标志基因特征图。j, 各条件细胞类型组成柱状图（c1-c5浓度，t0-21时间窗口）。

Fig. 1 | A single-cell transcriptomic atlas of human neural organoid patterning. 100,538 single cells from 97 morphogen treatment conditions across 3 hPS cell lines.

2形态发生素对转录调控网络的影响

为解析形态发生素如何影响基因调控网络，研究使用SCENIC分析了HES3 hES细胞系的筛选数据，将每个形态发生素处理与特定调节子（regulon）活性关联。结果显示，形态发生素通过激活或抑制特定转录因子调节子来驱动区域特化。

关键发现：形态发生素暴露的时间和浓度可以选择性调控不同调节子亚群的激活，从而驱动不同细胞命运的出现。例如，FGF8暴露早期（0-3天）与FOS、JUN和POU3F3调节子正相关，而晚期暴露（14-21天）则与EMX2、ARX和BARHL1正相关。

SHH处理激活了NKX2-1、DLX6、GBX2等下游调节子。BMP4处理激活MSX2、SMAD9等。RA激活HOXB2等后脑相关调节子。CHIR（WNT激活）则呈现与浓度相反的负相关性——高浓度CHIR抑制神经命运调节子，激活SOX10等神经嵴分化替代程序。

图2 | 形态发生素-调节子网络分析

形态发生素对特定调节子的活性影响呈现时间依赖性和浓度依赖性模式。a-c, 不同形态发生素处理下调节子活性的热图，显示富集/缺失模式。d, HCR染色验证RA诱导的视网膜前体细胞（低浓度SFRP2+）和后脑/底板命运（高浓度FOXA2+）。e, 形态发生素-调节子相关性网络。

Fig. 2 | Morphogen–regulon network computation for the patterning condition screen.

3形态发生素的时序、浓度和组合效应

RA的双重效应

RA处理表现出显著的时间依赖性双功能性：早期时间点（0-3天）的RA脉冲促进非神经外胚层，而晚期时间点（9-20天）则促进视网膜和后脑前体细胞。晚期长时间暴露于低浓度RA（c2-3）促进视网膜前体细胞（SFRP2+）出现，而更高浓度RA则逐步富集后脑和底板前体细胞（FOXA2+）。HCR原位杂交染色验证了这一浓度依赖性转换。

RA低浓度(c2-3) → 视网膜前体细胞(SFRP2+)；RA高浓度(c5) → 后脑/底板(FOXA2+)

WNT通路调控

WNT抑制（XAV939）在早期和中期时间点（0-3d, 10-13d, 14-17d）导致端脑前体细胞显著富集。WNT激活（CHIR）引起强烈的背侧化和后部化，产生神经嵴命运和PNS神经元。最高浓度CHIR还将细胞导向非神经命运。

BMP4 vs BMP7

两种BMP分子虽然通常被认为功能互换，但在本系统中显示显著差异：BMP4在早期（0-3天）导致类器官崩解，而BMP7诱导近90%间充质细胞。3天后，BMP4诱导非神经外胚层并逐步引导至视网膜命运；BMP7则将细胞导向多能性，即使晚期添加也是如此。长时间BMP4处理（12-20天）时，浓度增加导致视网膜前体细胞比例增加。BMP4特异性激活MSX2、TBX（神经嵴/背神经管）和FOXE3、SAMD11（视杯形态发生）基因。

BMP4 vs BMP7: BMP4显著改变细胞比例，BMP7处理与对照组基因表达模式高度相似

SHH vs FGF8

SHH和FGF8在特定时间点的短脉冲处理都诱导端脑命运，但FGF8的效应时间窗口更宽，SHH则局限于早期。长时间FGF8暴露（12-20天）在晚期耗尽端脑命运（与早期3-14天富集形成对比）。持续递增的SHH浓度诱导从端脑到下丘脑前体细胞的转变。在端脑内DV/AP评分分析显示，SHH比FGF8具有更强的腹侧化和前部化效应——最高浓度SHH产生下丘脑底板细胞，同时也产生更多前部化的端脑前体细胞。值得注意的是，SHH暴露诱导FGF8表达，但FGF8处理不诱导SHH或FGF8自身表达，这暗示小鼠和人类中FGF8的差异性作用。

🔬 惊喜发现：SHH是比FGF8更强的前部化信号——这与小鼠中FGF8从前神经嵴分泌促进端脑前部化的经典认知形成对比，暗示FGF8在小鼠和人脑模式化中的差异性角色。

图3 | 形态发生素时间、浓度和组合对细胞命运的调控

UMAP投影显示各处理条件下的细胞类型分布。不同形态发生素的时间窗口效应（早期vs晚期脉冲）、浓度梯度效应（c1-c5）和组合效应。

Fig. 3 | Morphogen timing, concentration, and combination effects on cell fate specification in developing neural organoids.

4组合筛选揭示形态发生素相互作用

为探索相关形态发生素组合，研究选择了时间和浓度条件设计了组合方案——XAV939、RA、CHIR沿AP轴模式化，Cyclopamine和SHH沿DV轴调制。额外条件包括FGF8与其他形态发生素组合。该实验在HES3（hES，XX）和WTC（hiPS，XY）两种细胞系中进行。

细胞系间的一致性与差异

不同形态发生素组合在两种细胞系间呈现不同一致性：CHIR始终诱导非神经命运。RA在两种细胞系中始终诱导后底板（WTC中还产生后脑和视网膜前体）。XAV939使WTC类器官前部化（端脑前体富集），但在HES3中却增加非神经外胚层和神经嵴命运——这是显著的细胞系间差异。

FGF8的调节作用

FGF8在HES3中对XAV939条件产生最大效应——消除非神经外胚层和神经嵴，促进神经身份（神经外胚层、神经上皮、端脑前体）。而在WTC中FGF8对RA条件的调节最强。RA单独处理时，后底板前体占53%、后脑前体占19.5%。加入SHH c5后，后底板比例升至87.8%，后脑前体被耗尽。而加入FGF8则将平衡移回后脑前体——与FGF8中脑-后脑边界角色一致。

RA alone: 53%后底板 + 19.5%后脑 | +SHH c5: 87.8%后底板 | +FGF8: 向后脑偏移

XAV939 + SHH协同作用

XAV939单独促进间脑、神经嵴和非神经外胚层命运。SHH单独诱导前脑组织渐进性腹侧化。两者组合则产生协同效应，导致更高比例的非神经外胚层细胞（通过非负最小二乘残差分析检测到非线性相互作用）。

图4 | 组合形态发生素筛选揭示相互作用

a, AP/DV组合方案设计（XAV939+SHH, RA+SHH, CHIR+Cyc等）。b, FGF8组合条件。c, 伪批PCA分析FGF8效应。d, MMD距离分析形态发生素相互作用强度。e-g, XAV939+SHH协同效应的非线性分析。

Fig. 3 | A combinatorial patterning screening reveals morphogen interactions across cell lines.

5细胞系和神经诱导方法对模式化结果的影响

研究比较了两种神经诱导方法（MNIM vs 双SMAD抑制）对5种多能干细胞系（H9、WTC、H1、WIBJ2、HES3，其中前4种用双SMAD，HES3用MNIM）的影响。在第21天收获类器官进行scRNA-seq，并分析细胞类型组成和可重复性。

细胞系背景的影响

WTC hiPS细胞系在对照条件下即展现出更强的非神经命运倾向，HES3和H9 hES细胞系更偏向端脑命运。使用两种神经诱导方法时，细胞系差异方向一致，但效应强度不同。KLD分析显示，双SMAD抑制条件在细胞系间呈现更高的变异性。总体而言，高浓度形态发生素处理条件下细胞系间变异性降低。

双SMAD抑制 → 更严格的神经命运获取，但更高的细胞系间变异性 | MNIM → 更多样化的神经外胚层+非神经组织，可重复性更高

AP-DV轴分析

高浓度SHH和RA在两种神经诱导方法中效果高度一致。CHIR早期脉冲在双SMAD条件下一致地将所有细胞系推向腹侧和后部，但在MNIM中细胞系间效应不一致。FGF8在两个浓度下均未能产生一致的AP-DV轴偏移。双SMAD产生的对照神经前体比MNIM更背侧化，且各细胞系在AP-DV空间中的分布差异显著。

调节子水平的一致性

GLI3调节子活性在所有细胞系中均被SHH一致抑制。RA激活的HOXB3（颈椎HOX基因）和CHIR激活的HOXC6（胸椎HOX基因）在细胞系间一致。相反，FOXG1、RFX2、POU3F2分别是CHIR、SHH和RA响应中变异性最大的调节子——既在细胞系间，也在神经诱导方法间。

🔬 关键结论：形态发生素对细胞系的影响在相同神经诱导方法内始终遵循相同方向；但MNIM与双SMAD之间存在调节子活性的相反方向变化——最明显的是CHIR处理中HOX调节子在双SMAD中被激活、在MNIM中被下调。

图5 | 跨细胞系和神经诱导方法的调节子一致性与变异性

a, MNIM和双SMAD抑制的推断调节子网络。b, 一致性和非一致性调节子示例。c, 调节子活性与形态发生素浓度的相关性热图。

Fig. 4 | hPS cell lines and neural induction method impact patterning outcome. Fig. 5 | Variable and consistent regulons across hPS cell lines and NIM.

6形态发生素梯度与前脑DV模式化

为测试形态发生素的梯度变化能否控制复杂人脑组织内背-腹侧端脑细胞的比例，研究使用了两种方法：

方法一：MiSTR微流控芯片——使用双输入微流控树状梯度发生器，在三维神经上皮片上施加SHH激动剂和WNT拮抗剂梯度。方法二：多孔板不连续梯度——神经类器官暴露于代表梯度中不同位置的离散浓度。

两种方法产生相似的细胞组成，但比例不同

两种数据集合并后观察到显著的区域化基因表达差异。类器官包含比微流控梯度组织更多的腹侧区域。在MiSTR中，低SHH区域产生皮层/侧神经节隆起（Ctx/LGE）前体；而在类器官中，即使最低SHH浓度也诱导更腹侧命运（MGE前体和MGE来源中间神经元）。高SHH在MiSTR中主要诱导MGE命运，在类器官中则诱导下丘脑命运（FOXG1^-, NKX2-1⁺）和间脑底板（FOXA2⁺）。

MiSTR: 从皮层到MGE的逐步变化 | 类器官: SHH浓度超过阈值时的二值式跳跃（直接跳到下丘脑样签名）

差异动力学机制

在第9天的早期时间点分析排除了PDMS吸收导致MiSTR中SHH浓度更低的可能——即使早期也已呈现从皮层-PSB-LGE到下丘脑的逐步变化，而类器官则呈跳跃式。活体荧光成像显示：在高SHH条件下，类器官中NKX2-1-GFP最初在局部区域出现（尽管全局暴露于SHH），然后逐渐扩散；而MiSTR单层培养中NKX2-1-GFP在第5天即呈现均一低表达，随后同步增加。这提示类器官中存在前馈机制——局部SHH信号通过相邻细胞放大，而在伪单层培养中这种放大受限。

🔬 核心发现：连续的形态发生素梯度（MiSTR）和不连续浓度步骤（类器官）都能在单一培养中产生区域化DV模式化，但模式化动力学根本不同——MiSTR呈渐变式层级过渡，类器官呈开关式阈值响应。

图6 | 形态发生素梯度与不连续步骤对前脑DV模式化的比较

a, 前脑DV模式化与区域标志基因。b, MiSTR微流控与96孔板实验设计。c-e, Harmony整合UMAP投影。f, 细胞类型组成。g-h, 各分段的组成。i, 前脑轴评分排序。j-k, HCR染色验证。l, MiSTR免疫组化。m, 光片活体成像显示NKX2-1-GFP局部诱导和扩散。

Fig. 6 | Morphogen gradients and discontinuous morphogen steps similarly recapitulate DV patterning of the human forebrain.

讨论

本研究提供了形态发生素时间、浓度和组合效应如何调控发育中人神经类器官的系统性评估。主要发现包括：

1. 形态发生素感受窗口：SHH、FGF8、RA、BMP4/BMP7和WNT通路调节剂具有特定的感受窗口。低浓度和高浓度的SHH和RA富集不同区域命运。RA与SHH协同刺激后底板形成，RA与FGF8协同产生后脑前体。WNT抑制（XAV939）与SHH激活联合增加非神经外胚层——这种现象仅在无双SMAD抑制时可见，凸显了神经诱导方法对形态发生素响应的影响。

2. 细胞系与方案变异性：在第21天收获使我们能在区域化事件期间测量模式化调节子活性，提供了独特的发育快照。未发现细胞系变异性的普遍规则，但识别出需要优化以实现可重复模式化的特定调节子和细胞类型。双SMAD抑制产生主要CNS命运但变异性更高，MNIM生成多样的神经外胚层和非神经外胚层组织但可重复性更佳。

3. MiSTR vs 类器官：MiSTR模型类似神经管的结构通过侧向抑制机制产生更温和的腹侧化，而类器官中局部分泌的形态发生素可能放大模式化信号。两种系统都生成与空间相邻脑区对应的复合组织——即使在均一条件下，内在自组织响应也能产生相关边界。高形态发生素浓度增加类器官均质性。

局限性：细胞系间差异和批次变化显著影响类器官结果变异性。类器官接种细胞数和处理开始时的尺寸影响模式化结果。分析聚焦于细胞组成和基因表达而非形态学和空间排列。培养基更换时间可能破坏内源性模式化梯度。

方法摘要

细胞培养：HES3(NKX2.1-GFP)、H9、WTC、H1、WIBJ2多能干细胞系。神经诱导：MNIM（minimal NIM）或双SMAD抑制（SB431542+Noggin）。

形态发生素处理：CHIR99021、FGF8、SHH/purmorphamine、BMP7、BMP4、RA、XAV939、Cyclopamine。时间窗口：早期脉冲0-3d/3-6d/6-10d等，延长时间0-21d/3-14d/9-20d/12-20d等。浓度：5水平(c1-c5)。组合：AP×DV设计。

scRNA-seq：细胞哈希(Cell hashing抗体)+10x Genomics 3′ v3 + NovaSeq 6000。Cell Ranger + Seurat 分析。

数据分析：RSS整合（参照Braun et al. 2023人脑图谱）、UMAP降维、SCENIC调节子分析、MMD距离、KLD、PCA、非负最小二乘残差分析。

微流控：MiSTR双输入树状梯度发生器（参照Rifes et al. 2020）。连续流动PDMS芯片。

📊 扩展数据图（10张）

Extended Data Fig. 1 — 条件筛选总览

Extended Data Fig. 1 | Overview of conditions and results of patterning condition screening. a, 所有实验条件概述。b, 测序指标（UMI数、基因数、线粒体比例）。

Extended Data Fig. 2 — 单细胞数据集注释

Extended Data Fig. 2 | Annotation of single-cell dataset resulting from the patterning condition screening. Dotplots显示各细胞簇的标志基因表达。

Extended Data Fig. 3 — 形态发生素时间与浓度调控

Extended Data Fig. 3 | Regulation of neural and non-neural cell fates by morphogen timing and morphogen concentrations. a-k, 各形态发生素（XAV939、CHIR、SHH、FGF8、BMP4、BMP7、RA、Cyclopamine）的浓度和时间梯度效应详情。

Extended Data Fig. 4 — FGF8 vs SHH / BMP4 vs BMP7 比较

Extended Data Fig. 4 | Comparing the effects of FGF8 versus SHH and BMP4 versus BMP7 treatment. a-h, FGF8和SHH对DV/AP评分的差异影响。SHH比FGF8具有更强的前部化和腹侧化效应。BMP4 vs BMP7差异表达分析。

Extended Data Fig. 5 — 调节子活性与形态发生素相关性

Extended Data Fig. 5 | Correlations between regulon activity and morphogen timing and concentration. FGF8早期和晚期暴露相关调节子差异。CHIR浓度与调节子活性的负相关分析。

Extended Data Fig. 6 — WTC组合筛选

Extended Data Fig. 6 | Morphogen combinations regulate neural cell fates (WTC). WTC细胞系组合筛选结果。RA/SHH/FGF8对后脑和后底板平衡的调控。

Extended Data Fig. 7 — 模式化变异性比较

Extended Data Fig. 7 | Comparison of patterning variability in the presence and absence of morphogen treatment. PCA投影和细胞系差异分析。

Extended Data Fig. 8 — 可重复性筛选数据集注释

Extended Data Fig. 8 | Annotation of regionalized patterning reproducibility screen single-cell dataset and projection to primary data. 投影到原始数据的分析。

Extended Data Fig. 9 — 模式化变异性（续）

Extended Data Fig. 9 | Comparison of patterning variability in the presence and absence of morphogen treatment (continued). 堆叠条形图和UMAP投影。

Extended Data Fig. 10 — MiSTR系统表征

Extended Data Fig. 10 | Characterization and data integration of MiSTR and MiSTR-like organoid cultures. a-h, 微流控系统详细分析。尽早时间点(day 9)显示两种系统的区域身份差异：MiSTR呈逐步过渡，类器官呈跳跃式响应。

系统性单细胞RNA测序筛选揭示神经类器官对形态发生素的响应图谱